Królowie polscy, a za ich przykładem polska i litewska magnateria, chętnie zatrudniali na swych dworach żydowskich lekarzy, nauczycieli czy dyplomatów. Zygmunt Stary zatrudniał na swoim dworze słynnego lekarza Izaaka z Hiszpanii, który był poprzednio lekarzem nadwornym Jana Olbrachta i Aleksandra. Zygmunt I Stary potwierdził Izzakowi nadane mu wcześniej przywileje, a po jego śmierci opiekował się wdową po nim, Bersabeą. Również królowa Bona miała swego lekarza, którym został sefardyjczyk Samuel bar Meszulam przybyły z Włoch.
Zygmunt August zatrudnił na swym krakowskim dworze słynnego lekarza rodem z Udine we Włoszech – Salomona Askenazego. Po wyjeździe z Polski w 1565 r. jego miejsce zajął lekarz Salomon Kalahora pochodzący z Hiszpanii. Wzorem króla polskiego postępował Jan Zamojski, który zaprosił do swojego Zamościa grupę sefardyjczyków z Turcji i Wenecji. Nadając im w 1588 r. przywilej, zrównał ich w prawach z innymi mieszkańcami miasta pochodzącymi z różnych części Europy. Zamojska gmina sefardyjska istniała do połowy XVII wieku, kiedy to przestała istnieć w wyniku wojny z Bohdanem Chmielnickim i jego Kozakami. Odrodziła się dopiero w II połowie XVII wieku już jako gmina aszkenazyjska i istniała do 1942 r.
Rozwój gmin żydowskich i wzrost ich liczebności powodował rosnącą niechęć szlachty i mieszczaństwa do Żydów. Szlachta na sejmikach ziemskich coraz częściej formułowała postulaty ograniczenia wpływów żydowskich, szczególnie w sferze życia gospodarczego. W 1539 r. pod wpływem silnych nacisków szlachty, król wydał konstytucję dzielącą Żydów na tych z miast królewskich i tych z miast i wsi prywatnych. Od tego momentu opieką królewską i jego jurysdykcją objęci będą jedynie Żydzi mieszkający w miastach i dobrach królewskich. Żydzi z miast i wsi prywatnych zostali podporządkowani sądownie i administracyjnie ich właścicielom.
Chęć ograniczenia osadnictwa żydowskiego w miastach w XVI wieku znalazła swój wyraz w staraniach władz miejskich o uzyskanie lub potwierdzenie przywileju zakazującego osiedlania się Żydów w mieście. Takie privilegia de non tolerandis Judaeis uzyskały: Międzyrzec w 1520 r., Warszawa w 1525 r., Biecz, Krosno i Tarnogród w 1569 r., Pilzno w 1577 r., Drohobycz w 1578 r., Mikołajów w 1596 r. czy Chęciny w 1597 r. Zakaz osiedlania się Żydów w miastach nie był przestrzegany rygorystycznie. Często powstawały przedmiejskie dzielnice, tzw. miasta żydowskie (m. in. w Lublinie, Piotrkowie, Bydgoszczy, Drohobyczu, Samborze). Czasem Żydom udawało się uzyskać cofnięcie dyskryminujących zarządzeń.
