Tu też, w wieku zaledwie 23 lat, został kierownikiem Zakładu Anatomii i Chirurgii. Sześć lat później ukazało się jego fundamentalne dzieło: „De humani corporis fabrica”, zadedykowane cesarzowi Karolowi V. Ściągnęło ono na Wesaliusza prześladowania władz kościelnych i sprawiło, iż w obawie przed inkwizycją opuścił Padwę. W 1544 roku Andreas poślubił Annę van Hamme, a w 1546 roku został nadwornym lekarzem cesarza Karola V.
Po jego zgonie (1559) przeszedł na służbę króla Hiszpanii Filipa II i pełnił ją aż do śmierci. Znakomity anatom zmarł wkrótce po powrocie z pielgrzymki do Ziemi Świętej w 1564 roku.
Materiał do swego fundamentalnego dzieła Wesaliusz gromadził przez wiele lat. Jego podstawę stanowiły wykonywane legalnie i nielegalnie sekcje zwłok ludzkich umożliwiające mu doskonałe poznanie anatomii człowieka.
„Obecnie nie spędzałbym już tak chętnie całych godzin na paryskim Cmentarzu Niewiniątek, przerzucając kości – pisał kilka lat później o niektórych swych praktykach – nie udawałbym się na ich poszukiwanie do Montfaucon [miejsce paryskiej szubienicy], gdzie raz, gdy byłem z towarzyszem, napadła na nas sfora dzikich psów [...] nie będę dłużej prosił studentów medycyny, aby informowali mnie o miejscu pogrzebania zwłok [...] i aby potem porywali wraz ze mną zwłoki. Już nie będę całymi tygodniami trzymał w sypialni nieboszczyków wykradzionych z grobu lub oddanych mi po publicznej egzekucji”.
Oprócz gromadzenia materiału niezbędnego do napisania „De humani corporis fabrica” Wesaliusz wyszukiwał również artystów, którzy szkicowali mu narządy i tkanki rozkładających się ludzkich trupów.
