Rozpoczęła się ona na początku 1498 roku, a uczestniczyło w niej 6 okrętów i 300 ludzi, z których sporą część stanowili warunkowo zwolnieni z więzień przestępcy. Sam admirał wypłynął z trzema karawelami na poszukiwanie nowego kontynentu - Antypodów 30 maja 1498 roku.
Tym razem trasa wiodła przez Wyspy Zielonego Przylądka i dalej, wzdłuż tzw. równoleżnika Sierra Leone (9 stopni i 30 minut szerokości geograficznej północnej). 31 lipca wyprawa dotarła do nieznanej wyspy. Po siedemnastu dniach – pisał Kolumb – w czasie których Bóg użyczył nam wiatrów pomyślnych, ukazała mi się wreszcie ziemia [...] jeden z majtków wspiął się na bocianie gniazdo i ujrzał na zachodzie trzy bliskie sobie góry. Zaśpiewaliśmy „Salve”, „Regina” i inne hymny i wszyscy razem złożyliśmy dziękczynienie Bogu [...] W godzinie nieszporów dotarłem do lądu, który nazwałem Cabo de la Galea [obecnie przylądek Galeota], nadawszy wprzód całej wyspie nazwę Trynidad. 5 sierpnia osiągnięto kontynent Ameryki Południowej w zatoce Paria. W ten sposób Kolumb stał się prawdopodobnie pierwszym Europejczykiem, który w epoce nowożytnej stanął na amerykańskim kontynencie. Płynąc dalej Kolumb odkrył deltę rzeki Rio Grande oraz jedno z ujść Orinoka; wyraził też przekonanie, iż być może ma do czynienia z nieznanym lądem, który nazwał Otro Mundi (Inny Świat).
Przypuszczam, że jest to ogromny kontynent, do dnia dzisiejszego nie znany – pisał admirał. – Do takiego przypuszczenia skłania mnie głównie istnienie wielkiej rzeki i słodkowodnego morza. Trapiony chorobą Kolumb rychło skierował się na północ, odkrył perłonośną wyspę Margeritę i pożeglował do Santo Domingo na Hispanioli. Wyprawa stanowiła wyczyn nawigacyjny najwyższej klasy, jako że ostatnią jej pewną pozycją były Wyspy Zielonego Przylądka. Potem była już tylko droga w nieznane.Na Hispanioli Kolumb zastał bunt hiszpańskich osadników kierowanych przez sędziego Francisca Roldana.
Po roku starć i pertraktacji doprowadził do ugody (1499 rok), zapoczątkowując na Antylach system tzw. repartimento, czyli nadań ziemskich dla Hiszpanów wraz z mieszkającymi tam Indianami. System ten rozprzestrzenił się we wszystkich koloniach Hiszpanii w Ameryce.
