Żydzi odgrywali już wtedy tak ważną rolę w administrowaniu i zagospodarowywaniu tych ziem, że trudno było wyobrazić sobie ich dalszy rozwój bez udziału tychże.
22 marca 1503 r. Aleksander oznajmił staroście grodzieńskiemu, że przyjmuje Żydów z powrotem, i polecił, aby oddano im w tym mieście budynek bożnicy, cmentarz, place w obrębie miasta wraz z budynkami oraz długi, jakie winni im byli chrześcijańscy mieszkańcy miasta. W zamian Żydzi zobowiązali się płacić roczny podatek zwany „powrotne” oraz sfinansować wystawienie 1000 jezdnych żołnierzy. W ślad za gminą grodzieńską zezwolenie na powrót otrzymały inne gminy miast królewskich, a także prywatnych.
Gminą najprężniej rozwijającą się na Litwie była gmina w Brześciu. Król Zygmunt Stary nadał Żydom brzeskim szereg praw i przywilejów ekonomicznych. Gmina brzeska przeżywa chwilowy kryzys po pożarze kwartału żydowskiego w 1568 r., ale wkrótce odbudowano ją dzięki pomocy króla Zygmunta Augusta. Król zwolnił Żydów od płacenia 1/3 podatku rocznego przez dziewięć lat, ale jednocześnie nałożył na nich obowiązek odbudowy domów przy użyciu cegły i kamienia. W centrum kwartału żydowskiego wybudowano murowaną synagogę oraz gmach jesziwy – wyższej szkoły talmudycznej – która szybko zyskała dobrą opinię i sławę w Europie.
Miastem, w którym stosunkowo późno osiedlili się Żydzi, było Wilno. Stolica Wielkiego Księstwa Litewskiego i główna siedziba władcy otrzymała w 1527 r. przywilej de non tolerandis Judaeis, co oznaczało zakaz osiedlania się Żydów. Wzorem innych miast w Rzeczypospolitej, także i w Wilnie, zakaz ten nie był rygorystycznie przestrzegany. W obrębie murów miejskich zamieszkiwały pojedyncze rodziny żydowskich kupców, celników czy kredytodawców. W 1551 r. król Zygmunt August zezwolił na osiedlanie się Żydów na terenie nieruchomości należących do bojarów litewskich. Pierwsi skorzystali z tego Żydzi podlegający jurysdykcji rodziny Słuckich. Osiedlili się oni w Wilnie, tworząc zwartą i dobrze zorganizowaną społeczność. W 1573 r. otworzyli tu pierwszą drewnianą synagogę. Szybko rosnąca liczba Żydów prowadziła, tak jak i w innych miastach Rzeczypospolitej, do konfliktów z chrześcijańskim mieszczaństwem. Doprowadziło to do wyznaczenia w 1629 r. granic dzielnicy żydowskiej, z czasem nazywanej Czarnym Miastem.
Tworzył je rozbudowany labirynt ciemnych i wąskich uliczek, przejść i zaułków. W kilka lat później wzniesiono w jej centrum największą wówczas w Rzeczypospolitej bożnicę, nazywaną Wielką Synagogą. Niezwykle szybko gmina wileńska uzyskała dominującą pozycję wśród gmin litewskich. W połowie XVII wieku społeczność żydowska Wilna składała się z 262 rodzin – razem 1310 osób. Podobna liczba mieszkała poza dzielnicą, w rozproszonych po całym mieście posiadłościach szlacheckich i duchownych. Na mocy przywileju wydanego przez Władysława IV w 1633 r. Żydzi wileńscy mogli zajmować się wszystkimi dziedzinami handlu i rzemiosła. Uzyskali też zgodę na wyłączność produkcji i sprzedaży alkoholu w mieście. Zezwolono im na odprawianie swoich nabożeństw, założenie cmentarza, zbudowanie rytualnej łaźni – mykwy, oraz rzeźni. Wyrazem wzrostu znaczenia gminy wileńskiej była jej dominująca pozycja w powstałym w 1623 r. Sejmie Żydów Litewskich.
